Cara Membedakan Bagaimana Pengurutan Illumina Bekerja

Pengurutan Illumina adalah metode pengurutan generasi berikutnya , yang juga disebut metode ” pengurutan demi sintesis “. Pengurutan Illumina terlibat dalam pemrosesan jutaan fragmen secara paralel. Empat langkah dasar yang terlibat dalam alur kerja pengurutan Illumina adalah persiapan pustaka, pembuatan klaster, pengurutan, dan analisis data, yang dijelaskan lebih lanjut dalam artikel ini.

Topik bahasan kami tentang:

  1. Apa itu Illumina Sequencing – Definisi, Fakta, Keuntungan 2. Bagaimana Cara Kerja Illumina Sequencing – Proses Illumina Sequencing: – Persiapan Library – Pembuatan Cluster – Sequencing – Analisis Data

Istilah Kunci: Pembuatan Cluster, Analisis Data, Pengurutan Illumina, Persiapan Pustaka, Pengurutan berdasarkan Sintesis

Yang perlu anda ketahui tentang Urutan Illumina

Illumina Sequencing atau teknologi sequencing-by-synthesis (SBS) adalah teknologi sekuensing generasi berikutnya yang paling banyak digunakan di dunia. Lebih dari 90% data pengurutan dunia dihasilkan oleh pengurutan Illumina. Ini awalnya dikembangkan oleh Shankar Balasubramanian dan David Klenerman di Universitas Cambridge. Mereka mendirikan perusahaan yang dikenal sebagai Solexa pada tahun 1998. Kemudian Illumina membeli Solexa pada tahun 2007, dengan cepat meningkatkan teknologi aslinya. Maka dari itu, metode ini juga disebut metode pengurutan Solexa/Illumina . Keuntungan utama dari pengurutan Illumina adalah ia memberikan hasil pembacaan bebas kesalahan yang tinggi.

Bagaimana Pengurutan Illumina Bekerja

Empat langkah yang terlibat dalam pengurutan Illumina dijelaskan di bawah ini.

Langkah 1. Persiapan Perpustakaan

  • Pustaka sekuensing disiapkan dengan tagmentasi DNA secara simultan menjadi segmen pendek 200-600 pasangan basa oleh transposase dalam proses yang dikenal sebagai tagmentasi, diikuti dengan ligasi adaptor ke ujung 3′ dan 5′ dari segmen pendek DNA.
  • Motif tambahan seperti pengurutan situs pengikatan primer, indeks, dan wilayah, yang melengkapi oligo sel aliran ditambahkan ke adaptor di kedua sisi dengan amplifikasi siklus yang dikurangi . Tagmentasi dan penambahan motif ditunjukkan pada gambar 1 .

Gambar 1: Tagmentasi dan Penambahan Motif

Langkah 2. Pembuatan Cluster

  • Pustaka pengurutan yang disiapkan didenaturasi dan dimuat ke dalam sel aliran untuk pembuatan klaster. Selama pembuatan cluster, setiap fragmen di perpustakaan pengurutan diperkuat secara isotermal. Sel aliran terdiri dari kaca yang berisi jalur. Setiap jalur dilapisi dengan dua jenis oligonukleotida. Satu jenis melengkapi wilayah 5′ dari motif tambahan dan tipe lainnya melengkapi wilayah 3′ dari motif tambahan dari perpustakaan yang disiapkan. Maka dari itu, oligo ini mengikat ke daerah DNA yang sesuai di perpustakaan sekuensing. Aliran sel dengan dua jenis oligo ditunjukkan pada gambar 2 . Oligo yang mengikat ke wilayah 5′ dari perpustakaan pengurutan berwarna merah muda sedangkan oligo yang mengikat wilayah 3′ dari perpustakaan pengurutan berwarna hijau.

Gambar 2: Aliran Sel

  • Setelah perpustakaan sekuensing untai tunggal terikat pada oligo, untai komplementer dihasilkan oleh DNA polimerase . Kemudian, DNA untai ganda yang dihasilkan didenaturasi dan untai asli dicuci.
  • Amplifikasi klonal dari fragmen dicapai melalui amplifikasi jembatan . Selama proses ini, untaian terlipat di atas jenis oligo kedua pada sel aliran. Kemudian, polimerase mensintesis jembatan beruntai ganda. Denaturasi jembatan menghasilkan dua untai DNA: untai maju dan mundur pada oligo sel aliran.
  • Amplifikasi jembatan diulang berulang-ulang untuk mendapatkan jutaan cluster dari semua jenis fragmen secara bersamaan di perpustakaan pengurutan dengan amplifikasi klon. Amplifikasi klon ditunjukkan pada gambar 3 .

Gambar 3: Amplifikasi Klon

  • Kemudian untaian terbalik tersapu, hanya mempertahankan untaian maju pada sel aliran. Di untai depan, ujung 3′ bebas dan diblokir untuk mencegah priming yang tidak diinginkan.

Langkah 3. Urutan

Bacaan Pertama dari Urutan Terbalik

  • Sequencing dimulai dengan perpanjangan primer sequencing pertama . Metode sekuensing Illumina menggunakan dNTP yang dimodifikasi, yang mengandung terminator pada posisi 3′ gula deoksiribosa. dNTP ini juga diberi label fluoresensi dalam berbagai warna.
  • Setelah penambahan setiap nukleotida komplementer, kluster dalam sel aliran diamati untuk emisi fluoresensi.
  • Setelah deteksi cahaya, fluorofor dapat dicuci.
  • Kemudian gugus terminator dari posisi 3′ gula diregenerasi oleh gugus hidroksil, memungkinkan penambahan dNTP kedua ke rantai yang sedang tumbuh. Proses ini dikenal sebagai sequencing-by-sintesis. Urutan-oleh-sintesis ditunjukkan pada Gambar 4.

Gambar 4: Sequencing-by-Synthesis

  • Pada penyelesaian sintesis, pembacaan pertama dari urutan terbalik diperoleh dan produk urutan dicuci.

Indeks 1 Baca

  • Primer indeks 1 kemudian dihibridisasi ke cluster untuk menghasilkan pembacaan kedua dengan cara yang sama dengan mengurutkan demi sintesis. Produk sekuensing hanyut.

Indeks 2 Baca

  • Ujung 3′ cluster kemudian dideproteksi, memungkinkan hibridisasi ujung 3′ dengan jenis oligo kedua pada sel aliran (warna hijau). Dengan ini, urutan wilayah indeks 2 diperoleh. Produk sekuensing hanyut.

Bacaan Kedua Urutan Maju

  • Jenis oligo kedua diperpanjang oleh polimerase, membentuk jembatan beruntai ganda. Jembatan didenaturasi dan ujung 3′nya terhalang. Untai depan terhanyut.
  • Pembacaan kedua urutan maju diperoleh melalui sekuensing demi sintesis dengan hibridisasi dan ekstensi primer sekuensing kedua.

Langkah 4. Analisis Data

  • Miliaran bacaan yang diperoleh dengan pengurutan dikelompokkan berdasarkan urutan indeksnya.
  • Kemudian, urutan dengan bacaan yang sama dikelompokkan.
  • Bacaan maju dan mundur dipasangkan untuk membentuk urutan yang berdekatan.
  • Penjajaran ambigu dapat diselesaikan dengan urutan berpasangan.
  • Urutan yang berdekatan disejajarkan dengan genom referensi untuk identifikasi varian.

Video berikut menjelaskan proses lengkap pengurutan Illumina .

Kata terakhir

Pengurutan Illumina adalah metode pengurutan generasi berikutnya. Sekuensing Illumina terlibat dalam persiapan pustaka pengurutan dengan 200-600 pasangan basa fragmen DNA yang panjang. Empat langkah yang terlibat dalam pengurutan Illumina adalah persiapan perpustakaan, pembuatan klaster, pengurutan, dan analisis data. Karena pengurutan Illumina memberikan pembacaan urutan dengan akurasi tinggi, ini adalah metode pengurutan yang banyak digunakan di dunia.

Sumber bacaan:
  1. “Pengurutan dengan Teknologi Sintesis (SBS).” Teknologi Pengurutan | Urutan berdasarkan Sintesis , Tersedia di sini .
Sumber gambar:
  1. “Persiapan Pemrosesan DNA” Oleh DMLapato – Pekerjaan sendiri (CC BY-SA 4.0) melalui Commons Wikimedia 2. “Rantai oligonukleotida di Flow Cell” Oleh DMLapato – Pekerjaan sendiri, (CC BY-SA 4.0) melalui Commons Wikimedia 3. ” Pengurutan oleh sintesis Terminator yang dapat dibalik” Oleh Abizar Lakdawalla (bicara) – Saya membuat karya ini sepenuhnya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 4. “Pembuatan Cluster” Oleh DMLapato – Karya sendiri (CC BY-SA 4.0) melalui Commons Wikimedia

Related Posts