Kloning molekuler merupakan salah satu teknik dasar rekayasa genetika. Molekuler adalah metode mengisolasi fragmen DNA tunggal dari campuran besar. Dua vektor kloning, plasmid bakteri dan fag (virus), paling banyak digunakan. Setiap vektor ditumbuhkan pada sel bakteri dan dapat menampung DNA asing tanpa mengganggu kemampuan replikasinya.
Jika memungkinkan untuk mengkloning seluruh organisme, juga memungkinkan untuk mengkloning gen atau fragmen DNA. Operasi ini disebut kloning molekuler, yang merupakan bagian penting dari kegiatan yang dilakukan di laboratorium penelitian di mana biologi molekuler dan genetika dipraktikkan. Ini didasarkan pada serangkaian teknik rekayasa genetika yang memungkinkan untuk mengisolasi dan mereproduksi gen.
Kloning Molekul Dan DNA
Gen resistensi antibiotik dari plasmid memfasilitasi isolasi dan identifikasi plasmid rekombinan. DNA asing yang dibelah oleh endonuklease Pst 1 ketika dimasukkan ke dalam situs tunggal Pst 1 dari gen resistensi ampisilin plasmid bertindak sebagai mutasi pada gen resistensi. Karena plasmid juga memperoleh gen resistensi tetrasiklin fungsional, plasmid dapat dipulihkan sebagai klon dengan transfeksi menjadi mikroba sensitif yang ditumbuhkan pada media yang mengandung tetrasiklin. Sebuah molekul plasmid rekombinan tunggal menimbulkan koloni mikroba yang resisten terhadap tetrasiklin tetapi sensitif terhadap ampisilin.
Dengan demikian, fragmen DNA endonuklease restriksi dikloning. Metode ini menyediakan 1 (T hingga 10 klon rekombinan per ng DNA. Fragmen DNA rekombinan biasanya kecil (1 hingga 7.000 pasangan basa). Bakteriofag K menyediakan metode untuk mengkloning fragmen DNA yang lebih besar (20.000 pasangan basa) dengan efisiensi yang lebih tinggi (10 * sampai 10 * rekombinan Bagian tengah (20.000 pasangan basa) dari 40.000 pasangan basa bakteriofag dihilangkan oleh endonuklease restriksi dan diganti dengan DNA asing.
Bakteriofag rekombinan mudah diidentifikasi, karena hanya bakteriofag yang dikembalikan ke ukuran kira – kira 40.000 pasangan basa yang dapat dikemas ke dalam partikel virus, menginfeksi sel mikroba, dan membentuk plak (Gbr. 34-2). Setiap plak adalah produk infeksi dengan satu molekul dan dengan demikian mengandung fragmen DNA asing. Metode ini memungkinkan kloning molekuler dari genom individu dalam 10 “sampai 107 bakteriofag dari jumlah digram DNA. Baru-baru ini vektor kloning yang dirancang secara rekombinan yang mewujudkan keunggulan plasmid dan bakteriofag telah dikembangkan. Vektor ini, kosmid, mengkloning 40.000 urutan pasangan basa dengan efisiensi tinggi.
DNA manusia yang digunakan dalam kloning molekuler berasal dari nukleus (genomik) atau salinan DNA (cDNA) dari messenger RNA yang disintesis secara in vitro. Strateginya berbeda untuk isolasi rekombinan gen penyakit individu. Kloning dari 3 hemoglobin, imunoglobulin, insulin, dan hormon pertumbuhan menggunakan kloning cDNA, karena sel-sel khusus tersedia di mana 10 hingga 90 persen mRNA berhubungan dengan gen masing-masing metode ini memungkinkan isolasi sebagian kecil genom manusia. 10 * sampai 1 (F) dalam vektor mikroba Rekombinasi dengan mudah diperkuat ke jumlah miligram fragmen gen untuk studi kimia rinci Kesederhanaan metode memungkinkan perbandingan langsung gen penyakit pasien normal dan individu.
Kesimpulan Tentang Kloning Molekuler :
Kloning molekuler melibatkan mengisolasi dan memurnikan gen atau fragmen DNA dari organisme tertentu. Gen ini atau fragmen DNA murni ini kemudian dimasukkan ke dalam organisme lain, paling sering uniseluler (bakteri atau ragi) atau kadang-kadang ke dalam sel dalam kultur dari organisme multi-seluler. Dengan membagi bakteri, ragi atau sel dalam kultur akan menghasilkan klon sendiri yang masing-masing akan berisi satu atau lebih salinan gen atau fragmen DNA yang akan direproduksi. Hal ini memungkinkan untuk memperoleh sejumlah besar salinan dari fragmen DNA yang menarik yang ingin dipelajari.